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A la chasse aux mutations des gènes responsables des maladies

Cancer, mucoviscidose, myopathie… ces maladies sont dues aux anomalies de nos gènes. Déceler ces "mutations" revient à chercher la lettre fausse dans un texte, l'ADN, qui compte trois milliards de caractères. La chasse à la mutation génétique reste une aventure qui demande minutie et persévérance.

ADNNotre ADN est un enchaînement de plus de trois milliards de bases.
© M.Depardieu / Inserm

Un grand nombre de maladies comme la mucoviscidose, la myopathie de Duchenne et Becker ou certains cancers, sont dus à des mutations génétiques. Nos cellules fabriquent différentes protéines, essentielles à la vie cellulaire, dont le plan de construction est inscrit dans nos gènes. Lorsqu'un gène est abîmé, la protéine est modifiée ou plus du tout fabriquée. Les cellules ne fonctionnent plus normalement. Aujourd'hui, les scientifiques sont capables de plonger dans les gènes pour y repérer ces erreurs. Il leur suffit de quelques gouttes de sang et d'une poignée d'heures de travail pour savoir si une personne est atteinte d'une maladie génétique. De plus en plus utilisées, ces analyses restent toutefois très compliquées à réaliser.

Pour en comprendre toute la complexité, un rappel s'impose. Les gènes sont des morceaux du fameux ADN qui est une sorte de long texte écrit à l'aide d'un alphabet de quatre lettres, les bases. Au total, notre ADN est un enchaînement de plus de trois milliards de bases. Le plus petit gène en comprend au minimum un millier, le plus long deux millions ! La détection d'une mutation, qui consiste à repérer une erreur dans le texte du gène, "revient à chercher une aiguille dans une meule de foin", relate Pascal Soularue, responsable au Commissariat à l'énergie atomique (CEA) de la production de puces à ADN, un des outils envisagés pour cette détection.

En la matière, plusieurs techniques sont aujourd'hui disponibles. La plus ancienne, appelée séquençage consiste à lire et comparer, base après base, le texte du gène muté et celui du gène normal afin de trouver la base fautive. "Cette méthode peut s'avérer longue, mais c'est aussi la plus fiable, reconnaît Pascal Soularue. D'ailleurs, elle est utilisée pour vérifier les résultats obtenus avec les autres techniques." Parmi ces dernières, les puces à ADN, dont celles produites par l'équipe du CEA au Genopole® d'Evry, offrent une approche plus globale. Elles permettent de s'attaquer à des morceaux de gène assez longs et donc de trouver une mutation perdue au milieu de plusieurs milliers de bases.

Quelle que soit la méthode utilisée, la détection des mutations a toujours le même objectif : une meilleure connaissance des maladies génétiques et notamment de leur évolution. En effet, il arrive que la gravité d'une maladie dépende de l'endroit où un même gène est muté. C'est le cas, par exemple, de la myopathie de Duchenne et Becker. Le gène qui pose problème produit la dystrophine, une protéine qui sert à la bonne tenue des fibres musculaires. Certaines mutations entraînent un léger dysfonctionnement de la protéine, d'autres bloquent totalement sa production. Ces différences se traduisent par une évolution plus ou moins grave de la maladie. Plus généralement, la détection des mutations permet de confirmer les diagnostics des médecins.

Enfin, les chercheurs espèrent bien pouvoir corriger ces erreurs dans les gènes, afin qu'ils fonctionnent à nouveau correctement. C'est ce qu'on appelle les génothérapies. Mais, ceci est une autre histoire…

01.Chercher l'erreur ...

Nos cellules fabriquent différentes protéines, essentielles à la vie cellulaire, dont le plan de construction est inscrit dans nos gènes. Lorsqu'un gène est abîmé, la protéine est modifiée, ou plus du tout fabriquée. Les cellules ne fonctionnent plus normalement. Il est essentiel de dépister ces erreurs pour mieux soigner les maladies génétiques.

Morceau d'ADNLes gènes sont des morceaux de l'ADN, sorte de long texte écrit à l'aide d'un alphabet de quatre lettres, les bases.
© Genopole
Ces dernières années, la détection des mutations génétiques a fait un bond en avant grâce à des outils de plus en plus précis et rapides. "Ainsi, prochainement, nous devrions pouvoir analyser des gènes entiers en quelques minutes, explique Pascal Soularue, responsable de la plate-forme de production de puces à ADN du Commissariat à l'énergie atomique (CEA) au Genopole® d'Evry. Toutefois, même si les techniques sont très performantes, l'opération reste délicate." En effet, il s'agit de repérer la base en cause parmi des milliers de consœurs qui composent le gène. Cela revient, pour les chercheurs, à détecter une faute d'orthographe dans un texte comprenant parfois des milliers de lettres ! Autant dire que la mutation ne se laisse pas observer facilement.

Séquençage classique ou puce à ADN, quelle que soit la méthode choisie, l'histoire de la quête de la base erronée débute toujours avec le recueil de l'ADN à analyser. Ce dernier est extrait, en général, de certaines cellules du sang, les globules blancs. Une fois extrait, l'ADN est coupé en morceaux grâce à des enzymes. Ces protéines sectionnent les gènes à des endroits très précis. Cette opération permet de réduire le champ des recherches. En effet, les chercheurs ne vont garder que la zone du gène dans laquelle la mutation risque de se trouver. Ainsi, le petit bout d'ADN est dédoublé, et l'ADN simple brin à ausculter est "photocopié" - les spécialistes parlent d'amplification - en plusieurs milliers d'exemplaires grâce à une technique appelée PCR (Polymerase chain reaction / réaction en chaîne par polymérase). "Même bien maîtrisés, ces préliminaires sont toujours subtils car dès que l'on manipule de l'ADN pour chercher à l'amplifier, on prend le risque d'induire une erreur dans l'enchaînement des bases", tient à souligner Pascal Soularue. Ensuite, lorsque les copies de l'ADN à étudier ont été obtenues dans les règles de l'art, la recherche de la mutation proprement dite peut commencer.

02.Techniques et méthodes

Aujourd'hui, les chercheurs disposent de plusieurs outils qui ont tous des avantages et des inconvénients. Le séquençage appelé "classique" est la méthode la plus ancienne. Elle consiste à lire le brin d'ADN, base après base. La mutation est repérée par comparaison avec la séquence du gène normal. Certes, cette technique n'est pas très rapide ; car plus l'enchaînement des bases est long, plus il faut de temps pour le lire. En revanche, comme l'assure Pascal Soularue, "elle est très fiable et a notamment servi au séquençage du génome humain." Actuellement, elle est utilisée pour découvrir où se cachent des mutations qui n'ont pas encore été cartographiées et pour valider les résultats obtenus avec les autres outils de détection.
Chercheur généticien au GenopolePour les chercheurs, repérer la base en cause parmi des milliers de consœurs qui composent le gène, cela revient à détecter une faute d'orthographe dans un texte comprenant parfois des milliers de lettres !
© Genopole

Depuis une vingtaine d'années, le compromis entre fiabilité et rapidité est assuré par les puces à ADN. Comme son nom l'indique, cette technique se fonde sur ce qui se passe dans la nature, c'est-à-dire sur la parfaite complémentarité entre les deux brins d'ADN. La puce est une lame de verre ou de silicium sur laquelle sont fixés des milliers de bouts d'ADN simple brin dont les enchaînements de bases sont connus. Ensuite, la plaque est mise en contact avec l'ADN simple brin à analyser qui ne va s'apparier - s'hybrider - qu'avec le morceau qui lui est parfaitement complémentaire. Connaissant le texte de la lame, les chercheurs en déduisent celui du gène muté ; la mutation est alors débusquée.

Aujourd'hui, le CEA produit des puces qui contiennent 25 000 gènes sur des lames de quelques centimètres carrés (entre 10 et 12 cm²). "C'est beaucoup moins impressionnant que les puces de la société californienne Affymetrix qui contiennent près de un à quatre millions de sondes d'ADN sur une surface d'un centimètre carré, ou celles d'autres de ses concurrents", reconnaît Pascal Soularue. D'ici quelques années, grâce aux nanotechnologies, c'est-à-dire aux techniques qui permettent de travailler au millionième de millimètre, la détection d'une mutation perdue parmi plusieurs milliers de bases devrait pouvoir se faire sur des puces de plus en plus petites, le tout en quelques minutes. "Schématiquement, il sera alors possible, à partir d'une simple goutte de sang placée sur une lame de la taille d'une puce de carte bancaire, de lire le génome d'une personne, se réjouit l'ingénieur. Toutes les étapes de la détection des mutations pourront être faites sur ces puces, véritables laboratoires miniaturisés."

En attendant ces futurs "nanolaboratoires", les actuels outils de détection des mutations rendent d’ores et déjà de nombreux services. La première application qui vient à l'esprit est la confirmation d'un diagnostic de maladie génétique. Dans ce cas, la mutation est connue et les chercheurs vérifient si elle est présente ou non dans le génome du malade. Par ailleurs, certaines pathologies sont plus ou moins graves en fonction de l'endroit où le gène concerné est muté. Connaître la mutation permet donc d'anticiper l'évolution de la maladie. Les autres applications concernent les laboratoires de recherche. En effet, ces outils pourraient permettre non seulement de découvrir de nouvelles mutations, mais aussi d'évaluer, par exemple, le bénéfice des thérapies.

03.Diversité des maladies et puces ADN spécifiques

Les différentes anomalies génétiques

Comme leur nom l'indique, les maladies génétiques sont dues à des anomalies situées dans les gènes. Ces erreurs sont de trois types. Quand il manque un bout du gène, on parle de délétion. Il arrive également qu'un morceau du gène soit répété à tort. Ce sont les extensions. Enfin, lorsqu'une seule base du gène est modifiée, il s'agit d'une mutation.

Il existe trois types de mutations classées en fonction des conséquences qu'elles ont sur l'expression du gène. Elles sont qualifiées de muettes lorsqu'elles ne changent rien à la traduction et donc à la composition de la protéine synthétisée. D'autres, au contraire, les mutations substitutives, entraînent des modifications dans cette composition. Dans ce cas, la protéine est mal produite. Enfin, les mutations STOP entraînent l'arrêt total de la traduction.

Mais qui dit maladies génétiques ne dit pas forcément maladies héréditaires. Pour retrouver une mutation dans toutes les cellules d'un organisme, elle doit avoir été transmise par les parents ou être apparue très tôt au cours du développement du fœtus. Par ailleurs, les 30 000 gènes de notre ADN ne sont pas actifs tous en même temps. Par exemple, une cellule du foie ne met pas en jeu exactement les mêmes gènes qu'une cellule du cœur. Ainsi, une mutation pourra être néfaste pour le foie, mais inoffensive dans le cœur pour peu qu'elle soit sur un gène qui n'est pas sollicité dans ces cellules cardiaques. Enfin, des mutations génétiques ne touchant que certaines cellules peuvent survenir plus tard dans la vie. Dans ce cas, il n'y a pas de transmission possible. Ces modifications génétiques ne sont pas héréditaires.
Séquençage du génome humainLe séquençage du génome humain a abouti, début 2001, à une séquence presque complète des trois milliards de lettres inscrites dans notre ADN.
© M.Depardieu/Inserm

La plate-forme de production de puces à ADN du CEA

En août 1999, le service de génomique fonctionnelle de la Direction des sciences du vivant du Commissariat à l'énergie atomique (CEA) s'est installé sur le site de Genopole® à Evry. Aujourd'hui, 400 des 1 000 mètres carrés de ce service sont dédiés à la production des puces à ADN.

"À l'origine, ces puces devaient servir aux études, menées par le CEA, portant sur l'influence des radiations sur les cellules, relate Pascal Soularue, responsable de la production. Mais, très vite, nous nous sommes rendus compte que ces techniques pouvaient intéresser d'autres équipes de recherche. C'est pourquoi le CEA a souhaité s'implanter au cœur de la cité du gène, sur le site de Genopole à Evry."

À peine trois ans plus tard, le pari était gagné. En 2002, le service de génomique fonctionnelle a produit presque 4 000 puces à ADN dont le quart à destination d'équipes de recherches et académiques extérieures. Les puces disponibles supportent de l'ADN humain mais aussi de souris, de levure (saccharomyces) ou de plante (Arabisdopsis). Ces trois derniers génomes sont ceux de modèles génétiques très utilisés en recherche fondamentale. Aujourd'hui, le service peut produire 10 000 puces par an.

Diversité des puces à ADN

Derrière l'appellation "puce à ADN", on différencie désormais les puces non pas selon leur taille, mais selon leurs applications : analyse de l'expression des gènes, génotypage, mise en évidence de délétions et de mutations, etc. Sont apparues également d'autres types de puces sur lesquelles on dépose non pas de l'ADN mais des anticorps ou des protéines. Elles apportent des compléments d'informations sur d'autres types de données, comme la présence de telle ou telle protéine par exemple.

Dans le cas des puces à oligonucléotides développées, par exemple, par la société américaine Affymetrix, mais aussi par Agilent ou Nimblegen, les fragments d'ADN sondes, appelés aussi oligonucléotides, sont synthétisés directement sur la plaque par photolithographie. C'est un peu comme si chaque base était incrustée dans la masse de la lame. Aujourd'hui, ces puces d'un centimètre carré renferment jusqu'à 150 000 fragments d'ADN ! L'avantage de cette puce est sa fiabilité. En effet, avec un tel potentiel chaque gène est représenté par plusieurs sondes sur une seule et même lame. Cela permet de vérifier en une seule manipulation que l'ADN à analyser s'hybride bien toujours avec le même fragment de la puce. Pour atteindre un même niveau de résultat avec une puce à ADNc, où chaque gène n'est représenté que par une sonde unique, il faut recommencer l'opération plusieurs fois.

"En quelques années, l'évolution a été très importante, souligne Pascal Soularue. On voit apparaître aujourd'hui des "lab on chip", qui sont de véritables laboratoires sur puce. Avec les nanotechnologies, une puce n'est plus seulement un support passif sur lequel on place des millions de sondes. Elle peut servir à faire des manipulations que l'on faisait jusqu'ici beaucoup plus lentement en laboratoire : extraction d'ADN ou d'ARN, PCR, migration sur gel, etc."

Ainsi, une première puce, baptisée Verflue (mise au point par la société ST Microelectronics associée avec Verdus), vient d'être mise sur le marché. Elle permet de détecter le virus de la grippe aviaire en deux heures (au lieu de plusieurs jours jusqu'ici) ! "À terme, on mettra une goutte de sang dans ce type de “lab on chip” et l'on obtiendra les 2 500 paramètres intéressants de cette goutte de sang." Il s'agit bien d'apporter au plus près du lit du malade des outils facilement utilisables en clinique.

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