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Les puces à ADN : un grand saut pour la recherche

Diagnostiquer des maladies, tracer les Organismes Génétiquement Modifiés, découvrir de nouveaux médicaments… Les puces à ADN ont de multiples applications. Ces simples lames de verre, sur lesquelles est fixée l'information génétique de nos cellules, provoquent une véritable révolution technologique.

Puce à ADNPuce à ADN utilisée lors d'un crible génétique chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Les puces à ADN permettent de mesurer et de visualiser très rapidement les différences d'expression entre les gènes.
© Institut Pasteur

« Les puces à ADN ne sont pas des puces électroniques comme celles des cartes bancaires », explique Pascal Soularue, chercheur au Commissariat à l'Energie Atomique (CEA) travaillant au Genopole d'Evry. « Ce sont des lames de verre pour microscope de 25x75 mm sur lesquelles on greffe des fragments d'ADN ». Ces fragments correspondent chacun à un gène. Une seule lame peut contenir jusqu'à 15 000 gènes.

Une image de l'expression de l'information génétique
« C'est une révolution technologique : avant on ne pouvait étudier qu'un seul gène à la fois », précise Pascal Soularue. Les gènes, déposés sur les puces, sont choisis en fonction de la nature de l'étude parmi les 25 000 gènes humains. Les travaux sur le génome d'animaux, de plantes ou d'organismes unicellulaires peuvent également utiliser ces supports.

Une fois les fragments d'ADN greffés sur ces lames, les puces sont ensuite soumises à une série d'opérations scientifiques qui vont permettre aux chercheurs d'obtenir une image de l'expression du génome. C'est-à-dire l'expression de l'information génétique qui varie d'un individu à l'autre.

Des champs d'applications étendus
Concrètement, cela permet d'étudier, par exemple, la différence d'expression des gènes de cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines, de diagnostiquer une maladie ou encore de nouveaux médicaments.
Outre la recherche fondamentale, les champs d'application de ces puces sont étendus : agro-alimentaire, agronomie, soins vétérinaires, ou encore environnement… Dans ce domaine, ils améliorent la surveillance des Organismes Génétiquement Modifiés (OGM), de bactéries, de toxines ou de pesticides dans les aliments.

Les puces à ADN sont sans cesse améliorées. « A terme, on devrait arriver à 22 000 gènes par lames », estime Pascal Soularue. Il faudra en outre réduire leur coût. Enfin, il faudra rendre la technologie plus mobile. Cela permettra de faire, par exemple, des analyses en plein champ pour détecter des OGM ou de faire un diagnostic directement au chevet des patients. « Un jour, la puce ne fera qu'un centimètre carré. On déposera une goutte de sang du malade et un lecteur nous donnera toute une batterie de résultats ! » explique Pascal Soularue.

01.Le principe

puces adn 003Puce à ADN sur substrat verre traité
© CEA-REA
Les puces à ADN, sortes de biopuces, sont utilisées au Genopole d'Evry pour analyser l'ensemble du génome humain en une seule étape. “ Ce ne sont pas des puces électroniques comme celle d'une carte bancaire ”, précise Pascal Soularue, chercheur au CEA (Commissariat à l'Energie Atomique) et travaillant au Genopole, “ Ce sont des lames de verre pour microscope de 25 x 75 mm, sur lesquelles on dépose des fragments d'ADN caractéristiques de gènes de séquence connue”.

Un gain de temps considérable
Inventées dès le début des années 90, elles permettent d'étudier jusqu'à 15 000 gènes en même temps. Les fragments d'ADN sont greffés sur la lame de verre ou de silicium. Ils peuvent aussi être synthétisés directement sur le support. Mais cette technique est moins utilisée car elle est plus coûteuse.

Les gènes, déposés sur les puces, sont choisis en fonction de la nature de l'étude parmi les 25 000 gènes humains. Le génome d'animaux, de plantes ou d'organismes unicellulaires peut aussi utiliser ce support. Ensuite, les puces à ADN sont mises en contact avec des ARN messagers (ARNm), marqués par un traceur fluorescent (fluorochrome). Le transcriptome, ensemble des ARNm d'une cellule, varie d'un type cellulaire à l'autre, mais aussi au cours de la vie de la cellule et de son état de santé. Cela permet d'étudier, par exemple, la différence d'expression des gènes de cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.

puces adn 002Robot GMS 417 (Genetic microsystems) servant à la préparation de puces à ADN sur verre par dépôt des sondes (fragments d’adn spécifique de certains gènes) sur les lamelles. Gros plan : phase de remplissage et de dépôt de la sonde sur la lame.
© CEA-STUDIO PONS
Les gènes fixés sur la puce sont appelés sondes. Chaque ARNm, ou cible (simple-brin), va s'hybrider spécifiquement sur son brin complémentaire. Les ARNm de cellules témoins sont marqués en rouge tandis que ceux des autres populations (cancéreuses, irradiées…) sont marqués en vert. La fluorescence émise par les traceurs est détectée puis photographiée. Ce qui permet d'obtenir deux images : une rouge et une verte. Chacune étant représentative d'un transcriptome.
Une fois les images superposées, la variation du niveau d'expression des gènes saute aux yeux. La couleur de chaque spot (dépôt où le gène est fixé) varie du rouge au vert. Lorsqu'il est rouge, c'est que le gène est réprimé (n'est plus exprimé). Lorsque le spot est vert, c'est que le gène est surexprimé. S'il est jaune sur l'image résultante, cela signifie que l'expression du gène est inchangée.

Avec le plan des dépôts, on liste les gènes surexprimés et réprimés ” explique Pascal Soularue, “ ils représentent les gènes potentiellement impliqués dans la maladie étudiée ou dans les processus de réponse à l'irradiation par exemple”.
Cette technique permet d'obtenir en une seule étape, et donc dans des conditions expérimentales rigoureusement identiques, une représentation du niveau d'expression de 15 000 gènes dans deux situations différentes.
C'est une révolution technologique : avant on ne pouvait étudier qu'un tout petit nombre de gènes à la fois ! ” précise Pascal Soularue. Les applications sont nombreuses, notamment en recherche fondamentale. “ La puce à ADN peut révéler la fonction d'un gène à partir de sa séquence ” poursuit le chercheur. “ Malheureusement, le séquençage à mettre tous les gènes en évidence et, pour certains, nous ne connaissons pas encore leur fonction, pourtant indispensable à la compréhension globale des mécanismes cellulaires ”.

02.Les puces et leur utilité

Une utilité dans des domaines variés
Les puces à ADN peuvent également révéler les liens entre les gènes. Après avoir inactivé l'un d'eux, les scientifiques observent quels sont les gènes réprimés ou quels sont, au contraire, les gènes surexprimés. Ainsi, des redondances fonctionnelles et des familles de gènes sont décelées. De même, les profils d'expression de différents tissus, de types cellulaires ou même d'un stade de développement cellulaire peuvent être caractérisés.
Outre la génomique, les puces à ADN ont bien d'autres d'applications. Dans le domaine médical, elles aident au diagnostic, au suivi thérapeutique... Pour chaque type d'application, l'essentiel est d'utiliser les sondes appropriées. Pour dépister une maladie, les sondes greffées sur la lame seront des gènes dont l'expression est caractéristique de telle ou telle maladie. Selon le profil d'expression du patient, un diagnostic est réalisé.

Dans le domaine pharmaceutique, biotechnologique et cosmétologique, les puces à ADN servent essentiellement aux criblages moléculaires et cellulaires dans le but, par exemple, de découvrir de nouveaux médicaments. Dans ce cas, le choix des sondes portera sur un échantillon représentatif du génome et les cibles proviendront de deux populations : des cellules témoins et des cellules qui auront été traitées par différentes molécules. Les effets de ces dernières sur l'expression des gènes sont ensuite observés. Ce qui révèle leur efficacité et leurs effets secondaires éventuels.

Puce à ADN 2Analyse transcriptionnelle du génome de Bacillus subtilis par puce à ADN. En vert : gènes activés. En rouge : gènes réprimés. En jaune : gènes non régulés. En noir : gènes non exprimés
© Institut Pasteur
En toxicogénomique (étude génétique de l'influence des facteurs environnementaux), le procédé est identique. Les cellules sont soumises à un stress (une irradiation, un polluant ou un médicament) dont la nocivité est analysée. Enfin, les puces à ADN ont de nombreuses applications dans les domaines de l'agroalimentaire, l'agronomie, vétérinaire ou encore de l'environnement. Elles améliorent la traçabilité d'OGM, de microorganismes, de pathogènes, de toxines ou de pesticides lors du contrôle qualité des aliments. Elles permettent aussi d'analyser des traits agronomiques de sélection, de faire des analyses bactériennes d'eau potable ou la détection d'agents infectieux dans l'air ou dans l'eau. Si l'on veut tracer des OGM, les sondes correspondront à différentes séquences introduites dans les plantes OGM.

Aider à soigner le cancer
Au CEA, nous étudions les effets d'irradiations sur les cellules ” indique Pascal Soularue. Grâce aux biopuces, l'équipe de chercheurs a réussi à mettre en évidence de nouveaux effets des irradiations sur l'expression de l'ADN. Pour cela, ils ont comparé le profil d'expression des cellules avant et après l'exposition au rayonnement en exposant les échantillons à différentes doses d'irradiation. Si les effets à fortes doses sont bien connus, ils le sont moins pour des doses plus petites.
La liste des gènes réprimés ou activés, suite à une faible exposition, fournit de précieux renseignements. L'étude se fait aussi en fonction des tissus et des types cellulaires. Après irradiation, les chercheurs ont remarqué une variation de la radiosensibilité. Par exemple dans le sang, les lymphocytes (globules blancs) sont les premiers à disparaître. Ils sont plus sensibles que les autres cellules sanguines. Les chercheurs veulent maintenant savoir pourquoi afin d'ajuster, par exemple, la radiothérapie à chaque patient atteint de cancer. Jusqu'à présent, les médecins soignaient les tumeurs par rayonnement avant même de savoir si le traitement serait efficace, alors que certaines tumeurs sont résistantes. Une analyse préliminaire de la tumeur par les biopuces permettrait d'éviter au patient une radiothérapie inutile.

Enfin, le CEA étudie les effets des irradiations par rapport au temps. Ce qui était impossible sans les puces à ADN. Par exemple, une heure après l'exposition, le profil d'expression de nombreux gènes change. Vingt-quatre heures après, il revient à la normale. Cela a permis de découvrir, notamment, un nouveau gène impliqué dans la réparation de l'ADN, abîmé par les rayonnements.

03.Regrouper les compétences

<img width="197" height="307" border="0" src="uploads/RTEmagicC_puces_adn_005.jpg" style="float:left; margin-right:14px; margin-bottom:14px;" alt="" /“ Depuis 3 ans, nous collaborons avec d'autres laboratoires ” explique Pascal Soularue. Un comité de sélection valide les projets des laboratoires candidats en fonction de leur pertinence et de leur adéquation avec l'utilisation de la biopuce : “ si le projet prévoit, par exemple, de ne s'intéresser qu'à quelques gènes, l'utilisation de puces peut s'avérer inutile ” ajoute-t-il.
Dans ce cadre, le CEA travaille avec deux laboratoires de l'Institut Pasteur et de l'Université Libre de Bruxelles, au sein de l'Association nationale de recherche sur le sida (ANRS). Leur mission : identifier les gènes activés lorsque le virus entre en contact avec les lymphocytes T4 (globules blancs). L'équipe de chercheurs participe également à un transfert de compétences avec différents laboratoires de la recherche publique francilienne sur l'utilisation des puces. Enfin, la plate-forme est ouverte à des projets de recherche à long terme cofinancés par des partenaires industriels.

Les collaborations entre laboratoires et entreprises en biophotonique, c'est justement une des missions d'Opticsvalley, technopole francilienne sur l'optique-photonique. Cette association à but non lucratif cherche à établir des pôles d'excellence dans ce domaine. La biophotonique est l'interaction entre l'optique et la biologie. Elle regroupe différentes techniques comme les lasers médicaux, l'imagerie cellulaire et tissulaire et les biopuces. En partenariat avec Opticsvalley et les incubateurs IDFI et IFSI, le Genopole a proposé aux jeunes pousses franciliennes de s'unir en consortium cet automne. Six sociétés (Atragène Bio-informatics, Bioret, Genescore, GeneWave, Genoptics et Serial Genetics) ont associé leurs forces pour mutualiser leurs expériences, savoir-faire et équipements.

Le problème, ce sont les brevets ” dénonce Pascal Soularue. Comme toutes les technologies performantes, avec un champ d'application vaste qui s'étend du domaine médical à l'agro-alimentaire, en passant par le domaine pharmaceutique, les biopuces sont l'objet d'une course au brevet. “ Affymetrix, (une société californienne leader du marché des puces à ADN) en a déposé beaucoup” signale le chercheur “ Théoriquement il faudrait qu'on paye une redevance pour chaque puce de plus de 1000 dépôts produite”…ce que ne peuvent pas se payer beaucoup de laboratoires. “ On ne risque pas grand-chose puisqu'on ne fait pas de bénéfices ” rajoute-t-il.
Il faut dire que le marché est juteux. Les puces à ADN sont déjà commercialisées depuis plusieurs années et ne cessent de s'améliorer. Parmi les applications les plus porteuses : la mise au point de tests biologiques pour la découverte de nouveaux médicaments. En s'association avec le Genopole d'Evry, Opticsvalley a étudié le potentiel de la biophotonique en France. Si le marché mondial des biopuces continue de progresser “ avec une croissance annuelle de 63 %, il sera de 3,3 milliards de dollars en 2004. Et le marché des “ arrayers ” et des “ scanners ” devrait atteindre 2 milliards de dollars d'ici 2008 ”, indique le rapport publié en octobre 2003.

Sur une seule puce, l'ensemble du génome humain peut être analysé en une seule étape. Les puces à ADN permettent ainsi de réaliser en quelques heures les expériences qui nécessitaient plusieurs mois auparavant. Elles ont donc entraîné un gain considérable de productivité en recherche biologique. En plus de cela, le coût baisse ! “ Le prix moyen d'une biopuce est aujourd'hui d'environ 100 euros et certains experts le voient à 10 euros à moyen terme ”.

La France a pris du retard sur les Etats-Unis dans ce domaine. Mais elle se rattrape par la création de centres d'excellence, le plus souvent spécialisés dans une des technologies de la biophotonique (imagerie, biopuces…) sur initiatives publiques ou privées. En observant ce qui s'est fait chez nos voisins, les pôles démontrent “ l'importance des alliances et collaborations pour percer le marché ” souligne Christian Marzolin d'Opticsvalley « De telles structures spécifiques favorisent l'interdisciplinarité par la mise en place de programmes de recherche, de partenariats industriels et de financements adaptés».

Le but des pôles d'excellence est aussi d'adapter les puces à ADN aux besoins. “A terme, on devrait arriver à 22 000 dépôts par lame ”, espère Pascal Soularue. D'autre part, une standardisation des protocoles expérimentaux et des résultats est nécessaire. La sensibilité et le rapport signal/bruit de fond sont aussi à améliorer. “ Pour le moment, les faibles variations d'expression sont difficiles à interpréter ”, précise-t-il. Enfin, réduire le coût et rendre la technologie plus portable permettraient de faire des analyses en plein champ pour détecter des OGM ou faire un diagnostic directement au chevet des patients. “ Un jour, la puce ne fera qu'un centimètre carré, on déposera une goutte de sang du malade et un lecteur nous donnera toute une batterie de résultats!” annonce le chercheur.

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